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今天推荐的是由意大利NazionaleConsorzio国际大学团队在年10月29日发表于Autophagy（IF：9.77JCR1区）的一篇文章，通讯作者是FrancescaDemarchi教授，研究表明USP1靶向ULK1并调节其细胞区室化和自噬。
USP1已被作为非小细胞肺癌治疗的潜在靶点和骨肉瘤的分化治疗。USP1除了在范可尼贫血的DNA修复途径中至关重要，还通过同源重组促进双链断裂修复。除此之外，USP1还能通过对ID2的去泛素化来预防骨肉瘤细胞的分化。
最近研究发现，随着小鼠胚胎干细胞分化，USP1mRNA水平降低。此外，在RAS转化的MCF10AT乳腺细胞中，USP1蛋白在CD44+CD24-癌症干细胞群中富集。ULK1激酶是自噬的关键调节因子。ULK1使BECN1（beclin1）磷酸化，从而激活磷脂酰肌醇3激酶，诱发经典的自噬通路。ULK1被CUL3泛素化（cullin3）会导致其被蛋白酶降解并导致自噬抑制。
本文中作者研究了USP1是否可以通过影响ULK1去泛素化来调控自噬发生。该研究证实了先前有关ULK1泛素化的研究，并进一步阐述了USP1对ULK1的调控可能诱导经典自噬通路与MAP1LC3B依赖的自噬通路的转换。作者认为，自噬平衡朝着非经典自噬通路转化可能有助于杀死癌细胞。
1.USP1调节哺乳动物细胞中ULK1的细胞区室化
WP对去泛素化酶的抑制作用会降低哺乳动物细胞提取物（TritonX-可溶性部分）中ULK1的蛋白水平。为证实这项研究，作者使用siRNA进行USP1敲低并发现其与U2OS，HEK和MCF10AT细胞的可溶部分中totalULK1和ULK1p-Ser的减少有关。野生型USP1的过表达可回补可溶性部分中ULK1和ULK1p-Ser的减少。作者还发现，AMPK对ULK1第位Ser的磷酸化对于其在自噬中的功能至关重要。
图1.USP1调节哺乳动物细胞中的ULK1
研究发现，USP1的敲低显著降低了可溶性部分中总ULK1的蛋白水平。这可能是由于蛋白质稳定性降低所致。但用蛋白酶抑制剂硼替佐米对USP1缺失的U2OS和MCF10AT细胞进行处理的实验表明，ULK1蛋白水平降低并非是因为这个原因。
图2.USP1调节哺乳动物细胞中的ULK1
通过荧光分析作者发现，DUB抑制剂WP会诱导GFP-ULK1定位到聚集体样结构中，并在细胞裂解后处于TritonX-不溶性沉淀中。另一方面，研究发现ULK1聚集体在USP1下调的细胞中明显存在。与预期一致，在沉淀部分中VIM（波形蛋白）和HDAC6（两个聚集体的marker）含量更高。USP1的另一靶标FANCD2也有类似的分布。
图3.USP1的降低与ULK1分隔/溶解度的变化相关
为了进一步确定USP1活性与内源性ULK1的细胞区室化相关，在用USP1抑制剂匹莫齐德处理后，通过免疫荧光和生化分级离心分析了ULK1的分布。结果显示，Pimozide会诱导内源性ULK1在4小时后定位到聚集体。
图4.USP1抑制剂匹莫齐特影响ULK1的区室及溶解度
作者通过免疫荧光分析和免疫沉淀实验验证了ULK1与泛素结合受体蛋白SQSTM1的共定位/相互作用。之前的研究表明，WIP处理会诱导形成GFP-ULK1聚集体，且内源性ULK1与SQSTM1有部分的共定位。通过免疫共沉淀实验发现，USP1敲低的细胞中SQSTM1-ULK1的相互作用强于对照组的细胞。正如预期，与对照组相比，USP1敲低细胞的澄清裂解物中ULK1蛋白水平降低。另一方面，SQSTM1-ULK1相互作用在USP1缺失的细胞中增加。
图5.USP1的缺失与SQSTM1-ULK1共定位的增加以及5M尿素增溶的沉淀中自噬蛋白的富集相关
为了探究USP1敲低时ULK1聚集体的特征，作者研究了ULK1与BECN1，HDAC6与SH3GLB1的共定位。结果显示，在雷帕霉素处理前后，USP1敲低的细胞中ULK1与BECN1有共定位，这表明BECN1也转移到ULK1聚集体上。不仅如此，USP1的下调与ULK1与HDAC6共定位的大量增加相关。与之相反，SH3GLB1没有与ULK1体共定位。
图6.USP1的缺失会增加BECN1-ULK1和HDAC6-ULK1的共定位
研究结论：在USP1敲低的细胞中，细胞裂解物的可溶部分中的UKL水平会降低，USP1的敲低会导致ULK1定位到聚集体中（aggresome）。USP1的敲低与SQSTM1-ULK1共定位的增加以及裂解物沉淀（可溶于尿酸部分）中自噬蛋白的富集相关。分级分离实验证明USP1的敲低会使ULK1定位到沉淀中。另一方面，免疫荧光实验证明在USP1敲低的细胞中，ULK1与BECN1和HDAC6有共定位。
2.USP1可与ULK1相互作用并使其去泛素化
作者已经证明，USP1敲低会极大地影响ULK1的区室化。为了研究这种影响是直接还是间接发生的，作者通过免疫共沉淀分析研究了ULK1-USP1的相互作用。USP1底物通常与USP1辅因子WDR48相互作用。因此，将编码MYC-WDR48的表达载体转染到完整的HEK细胞中，并在免疫沉淀和免疫印迹后监测可与WDR48相互作用的蛋白。正如预期，免疫沉淀实验证实USP1与MYC-WDR48可相互作用。
先前的研究证明雷帕霉素可诱导由TRAF6介导的ULK1的K63位泛素化。为了评估USP1是否与ULK1的K63位的去泛素化有关，作者分析了雷帕霉素治疗前后对照组和USP1敲低细胞中ULK1的泛素化状态。作者证实了雷帕霉素治疗后K63位泛素化会增加。有趣的是，USP1敲低大大增加了ULK1的K63位的单泛素化以及多泛素化水平。
研究结论：结果表明USP1可使ULK1去泛素化。
图7.USP1与ULK1相互作用并使其去泛素化
3.在USP1敲低的细胞中，经典自噬通路被抑制，而非经典自噬通路被持续激活
作者已经证明，在USP1敲低的细胞中，ULK1区室化发生了变化，其K63位的泛素化也有所增加。下一步作者希望探究USP1敲低对自噬的影响的是什么。实验发现，雷帕霉素诱导了对照细胞中自噬体的形成，但在USP1敲低的细胞中却没有诱导效果。该数据表明经典自噬的进行需要USP1的参与，并在USP1敲低的细胞中揭示了另一种MAP1LC3B依赖的自噬通路，该通路将SQSTM1引导至溶酶体清除。
图8.缺乏USP1的细胞中的自噬被减弱
在对照组细胞中，雷帕霉素处理后MAP1LC3B体的数量增加。在USP1缺失的细胞中，MAP1LC3B体在未经雷帕霉素处理的细胞中就已经存在。值得注意的是，在对照细胞中，雷帕霉素处理后，MAP1LC3B-SQSTM1共定位增加。与之相反，在USP1敲低的细胞中，MAP1LC3B-SQSTM1在未经雷帕霉素处理的条件下发生部分共定位。
图9.非经典自噬在USP1缺失的细胞中被激活
研究结论：实验结果表明，非经典自噬在USP1敲低的细胞中被激活，而经典自噬通路被阻碍。
4.靶向USP1可以帮助杀死具有自噬能力的癌细胞
关于乳腺癌样品中USP1蛋白水平的分析目前还没有文章报道。为了研究乳腺癌中的MAP1LC3B是否可能与USP1共表达，作者选择了95个浸润性乳腺癌样本的试验性样本，通过免疫组化分析肿瘤样品以评估USP1和MAP1LC3B蛋白。除一个样本外，所有ERBB2/HER2乳腺癌均为USP1阴性。尽管样本数量很少，但当考虑整个样本群体或仅三阴性肿瘤样本组时，作者发现USP1和MAP1LC3存在着显著相关性。这项初步的免疫组织化学研究证明，USP1和MAP1LC3B在95个乳腺癌样品中显著共表达。
图10.USP1和LC3蛋白在一部分乳腺肿瘤中表达并显著相关
抑制USP1的抗精神病药物匹莫齐特先前已显示可抑制某些乳腺癌细胞系的细胞增殖。作者研究了匹莫齐特是否可能减慢U2OS细胞的生长速度，以及此作用是否是USP1依赖性的。作者在添加匹莫齐特之前和之后对参照和USP1敲低的细胞进行计数，研究发现在最初的24小时后，匹莫齐特诱导USP1依赖性的细胞生长减缓。USP1敲低本身减慢了细胞的生长速度，但匹莫齐特治疗并未进一步增强这种作用。在添加匹莫齐特后48小时，细胞生长的下降不再取决于USP1。
为了验证依赖匹莫齐特的生长抑制效果至少部分是由于对自噬的抑制，作者将atg13和ulk1基因敲除的MEF的细胞活力及其对匹莫齐特的反应分别与各自的野生型对照进行了比较。在自噬受损的基因敲除的MEF中，匹莫齐特对细胞生长的抑制作用显着降低。
研究结论：这些数据揭示了一种针对依赖自噬生存的USP1阳性肿瘤的新型潜在治疗策略。
图11.吡虫嗪影响细胞生长和集落形成效率
作者证实，ULK1的泛素化作用会严重影响其区室化，且USP1可以使得ULK1去泛素化。作者还证明了USP1敲低会增加雷帕霉素处理引发的ULK1依赖的TRAF6蛋白K63位的泛素化，这表明USP1直接参与了去除ULK1第K63位连接的泛素化过程。研究还显示，尽管自噬需要ULK1的K63位泛素化，但在USP1缺失的细胞中，经典自噬通路被破坏。
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